En varias culturas, el uso tradicional de las plantas ha sido el pilar del mantenimiento de la salud. El efecto de estas plantas o extractos es conocido por una multitud de efectos beneficiosos, que incluyen antibacterianos, antivirales, antidiabéticos o antioxidantes, y han sido objeto de numerosos estudios [ 1 , 2 ].
Desmodium adscendens (DA) (Sw.) DC. Es una planta perenne de la familia Fabaceae que comúnmente crece en áreas tropicales de África, Sudamérica, Asia, Australia y Oceanía. Se ha utilizado durante muchos años debido a sus propiedades farmacológicas y valorado en las prácticas de medicina popular. Tradicionalmente, la DA se usa como una vid silvestre (decocción) utilizada en la selva amazónica del Perú, en los países de América del Sur y en la costa oeste de África. Se ha utilizado un extracto acuoso de las hojas para el dolor, la fiebre y también la epilepsia [ 3 ]. En África, la DA también se usa con frecuencia para tratar enfermedades relacionadas con problemas de contracción del músculo liso como el asma [ 4] En la medicina tradicional brasileña, las hojas de DA se usan para tratar una amplia gama de afecciones que incluyen gonorrea, diarreas, dolores corporales, micción excesiva e inflamaciones ováricas. En Francia se usa tradicionalmente como un suplemento de salud alimentaria por su efecto hepatoprotector, ya que se demostró que la DA tiene un efecto positivo contra la infección hepática in vivo [ 5 ]. Recientemente, las publicaciones sobre DA se centran en la composición química de DA de Ghana y Nigeria. Basado en la cromatografía en capa fina, Pothie et al . [ 6 ] caracterizó los principales compuestos en DA: flavonoides, triterpenos, saponinas, aminas y alcaloides. Baiocchi y col . [ 7] utilizó la espectrometría de masas de alta resolución para cuantificar saponinas y alcaloides. Los flavonoides durante un aislamiento guiado por actividad antioxidante se cuantificaron en material vegetal de África usando cromatografía líquida de alto rendimiento con detector de matriz de diodos, espectrometría de masas y espectroscopía de resonancia magnética nuclear multidimensional [ 8] Esta última caracterización química identificó el isovetixin-2 » – 0-xilósido (flavona C-glucósidos) como el compuesto principal en un extracto de etanol similar al suplemento dietético de plantas encontrado en Francia y Bélgica. La regulación europea desde 2006 requiere para los suplementos dietéticos la caracterización de todos los compuestos químicos presentes en los extractos de plantas. Un caso de farmacovigilancia en un extracto de desmodium fue declarado a la Dirección de Política de Competencia, Asuntos del Consumidor y Control de Fraudes y la ANSES. Una hepatotoxicidad aguda se asoció en una mujer al consumo de este extracto de plantas al mismo tiempo que otros 5 medicamentos (ANSES). Hay muy pocas publicaciones disponibles sobre la seguridad de la DA, y solo se ha evaluado la toxicidad aguda de la planta en un estudio de posibles defectos neurológicos [ 9] El DA se usa en Francia y Bélgica como un suplemento de salud alimentaria, en forma líquida emitida por una extracción alcohólica, pero su efecto nocivo potencial no se ha evaluado hasta donde sabemos sobre los hepatocitos.
El propósito de este estudio fue evaluar la seguridad de un extracto hidroalcohólico de DA en hepatocitos y células renales. También se evaluó el efecto citoprotector después del estrés oxidativo en las células renales.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y extracto
El extracto de la planta utilizado en este estudio es un extracto hidroalcohólico de las partes aéreas del DA africano con una relación de extracción de 1: 1. 1 g de extracto líquido corresponde a 1 g de planta seca.
Cultivo de células
Se obtuvo una línea celular epitelial de riñón de cerdo (LLC PK 1) y una línea celular de carcinoma hepatocelular de hígado humano (HepG2) de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Se cultivaron en matraces T-75 en medio 199 (M 199, LLC-PK1) o Medio de Eafle modificado de Dulbeco (HepG2) suplementado con suero de ternera fetal al 10% (Gibco) y penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 µg / ml) (Sigma-Aldrich, Francia) a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera humidificada como anteriormente hemos descrito [ 10 ]. Cuando los cultivos celulares alcanzaron aproximadamente el 80% de confluencia, las células se eliminaron usando tripsina al 0,25% en ácido etilendiaminotetraacético (Gibco) y se subcultivaron en placas de 6 o 96 pocillos. En la confluencia, las células se privaron de suero durante 24 h antes de la experimentación.
Prueba de viabilidad
MTS es un ensayo calorimétrico basado en la capacidad de las células viables para convertir 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio (MTS) (Promega, Francia) a formazan. La cantidad de formazán producida, medida por la absorbancia de 490 nm, es directamente proporcional al número de células viables en cultivo. Las células se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos (5 × 10 3células / pozo). Después del período de inanición en suero, el medio se retiró cuidadosamente y se reemplazó por 100 µl de diversas concentraciones de extracto DA (1 mg / ml, 10 mg / ml, 100 mg / ml) durante un período de incubación de 24 h. Luego, las células se incubaron con 20 \ mu l de compuesto de tetrazolio MTS durante 2 ha 37ºC. Durante la incubación, la sal MTS se reduce metabólicamente solo por células viables en un formazán insoluble de color, y la absorbancia / densidad óptica se leyó con un contador Victor 1420 Multilabel (WALLAC, EE. UU.) A una longitud de onda única de 490 nm.
Ensayo de citotoxicidad de la lactato deshidrogenasa (LDH)
Se cultivaron 15 x 10 4 células / pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos. El período de inanición en suero fue seguido por 24 h de incubación con las diferentes concentraciones de extracto de DA, dimetilsulfóxido (DMSO) o tritón X-100. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo y las células se lisaron en una solución salina tamponada con fosfato 1X / solución de tritón al 0,1% y se rasparon. Luego, la suspensión celular se sonicó durante 30 s y se centrifugó (1000 g, 10 min). Las mediciones de LDH se realizaron en sobrenadantes y suspensiones celulares, utilizando el método Roche IFCC (Roche / Hitachi Modullar P) en el Hospital Universitario de Poitiers.
Morfología celular
La microscopía de contraste de fase se realizó utilizando un Olympus CKX 41 (Olympus, Francia) y el programa de software Q-Capture Imaging Pro (Olympus, Canadá).
Citoprotección
Las células se sembraron a 3,10 5 células / ml en placas de 96 pocillos, crecieron hasta 80% de confluencia y se sincronizaron mediante una incubación de 24 h en el medio STARV a 37 ° C, seguido de una incubación de 24 h con las diferentes concentraciones de extracto de DA . Luego, las células se trataron con D-glucosa 30 mM durante 24 hy se realizó el ensayo MTS.
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como medias ± error medio estándar de cinco experimentos. El análisis estadístico se realizó mediante análisis de varianza (ANOVA) y luego después de la prueba de Dunnett (GraphPad Prism ® , GraphPad Software, San Diego, CA). Los valores de P <0.05 se consideraron estadísticamente significativos.
RESULTADOS
En este estudio, evaluamos la viabilidad celular y la liberación de LDH después del tratamiento de dos líneas celulares (HepG2 y LLC PK1) con un extracto de DA durante 24 ha tres dosis diferentes (1, 10 o 100 mg / ml) y después del tratamiento con triton × 100 [ Figura 1f ].
Cambios morfológicos observados bajo microscopía óptica. Aumento × 10. HepG2 (1) y LLC PK1 (2), (a) dimetilsulfóxido, (b) control, (c) extracto de desmodio de 1 mg / ml, (d) extracto de desmodio de 10 mg / ml, (e) desmodio de 100 mg / ml extracto, (f) tritón × 100
Las imágenes de los cambios en la morfología celular se ilustran en la Figura 1.1 para hepatocitos y en la Figura 1.2 para células renales. Las condiciones de control incluyeron el vehículo DMSO, células de control sin DMSO y tritón para la alteración química de la forma de la célula. Las Figuras 1.1 y 1.2 mostraron una alteración en la forma celular solo después de un tratamiento con 100 mg / ml en comparación con las células no tratadas y las expuestas a otras dos dosis de extracto de DA. Esta alteración de la forma celular se encontró en las dos líneas celulares (hepatocitos y células renales) a las mismas concentraciones de extracto de DA [ Figura 1.1 y 1.2e ].
Figura 2a yANDBb muestra los resultados de la evaluación de la viabilidad celular obtenido en HepG2 y LLC-PK1. El extracto de DA a 100 mg / ml disminuyó significativamentela viabilidad celular( P <0.05) en aproximadamente un 40% en comparación con el grupo control con y sin DMSO. El tratamiento de esta línea celular con 1 mg / ml o 10 mg / ml del extracto mostró una tendencia a aumentar la viabilidad celular entre 14% y 22%, aunque no estadísticamente significativo.
Efecto del extracto de Desmodium adscendens (DA) en el crecimiento celular. La viabilidad celular se midió mediante el ensayo 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio, (a) Viabilidad celular de la línea celular HepG2, (b) Viabilidad celular de la línea celular LLC PK1 incubada durante 24 h sin o con extracto de DA 1, 10 o 100 mg / ml), se utilizaron dimetilsulfóxido y tritón como controles negativos y positivos, respectivamente. Los datos se representan como media ± error estándar promedio de seis determinaciones. * P <0.05 versus control
Los resultados obtenidos en las células LLC PK1 y HepG2 muestran que el extracto de DA a 100 mg / ml indujo una disminución significativa ( P <0.05) de la viabilidad celular en aproximadamente un 35% en comparación con el control.
La liberación de LDH en el medio de cultivo de HepG2 y LLC-PK1 después de un tratamiento con extracto de DA a 100 mg / ml aumentó significativamente la lesión celular ( P <0.05) en un 7% y 16% en comparación con el control, respectivamente. El tratamiento de células como se muestra en la Figura 3a y andbb con el extracto de DA en 1 mg / ml o 10 mg / ml no muestran un aumento significativo en la liberación de LDH con independencia de la línea celular utilizada.
Efecto de Desmodium adscendens (DA) sobre la lesión celular evaluada por la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), (a) liberación de LDH de la línea celular HepG2, (b) liberación de LDH de la línea celular LLC PK1 incubada durante 24 h sin o con extracto de DA 1 , 10 o 100 mg / ml), dimetilsulfóxido y tritón se utilizaron como controles negativos y positivos, respectivamente. Los datos se representan como media ± error estándar promedio de seis determinaciones. * P <0.05 versus control
Efecto protector en células LLC-PK1
Después del tratamiento con el extracto de DA durante 24 h a diferentes dosis (1, 10 o 30 mg / ml) en células LLCPK-1, se indujo un estrés oxidativo al incubar las células durante 24 h en medio de cultivo sin suero saturado con D- glucosa (30 mM), y la viabilidad celular se midió usando el ensayo MTS. Los resultados presentados en la Figura 4 muestran que el estrés oxidativo inducido por glucosa disminuyó significativamente la viabilidad celular en aproximadamente un 60% ( P <0.05), y esta disminución se evitó mediante el tratamiento previo con 1 mg / ml o 10 mg / ml de DA ( P <0.05 ) De hecho, a la dosis de 10 mg / ml de extracto de DA, la viabilidad celular observada era indistinguible de la de las células de control. El tratamiento previo con 30 mg / ml de extracto de DA no dio lugar a la protección contra la disminución de la viabilidad celular inducida por el estrés oxidativo.
Efectos protectores del extracto de Desmodium adscendens (DA) contra el estrés oxidativo en la línea celular LLC-PK1. La viabilidad celular de la línea celular LLC-PK1 se midió mediante el ensayo 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio. El estrés oxidativo se indujo con glucosa alta (30 mM) y se incubó durante 24 h sin o con extracto de DA 1, 10 o 100 mg / ml). Los datos se representan como media ± error estándar promedio de seis determinaciones. * P <0.05 del control
DISCUSIÓN
Las hierbas medicinales se han convertido en una forma popular de terapia y los pacientes que se automedican con hierbas con fines preventivos o terapéuticos pueden suponer que estos productos son seguros porque son naturales. Sin embargo, cualquier producto puede volverse tóxico si no se usa correctamente [ 11 ]. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar la toxicidad potencial de un extracto hidroalcohólico de DA. Utilizamos dos líneas celulares bien definidas para apreciar los riesgos potenciales de daños hepáticos y renales [ 12 , 13] La seguridad del extracto de DA en HepG2 y LLC-PK1 varió de 1 mg / ml a 10 mg / ml de extracto de DA como lo sugiere la ausencia de cambios en la viabilidad celular o la morfología celular después de 24 h de exposición a estas concentraciones. Esto se correlacionó con una falta de aumento en la liberación de LDH en ambas líneas celulares.
Por otro lado, nuestros datos sugieren que la concentración de 100 mg / ml de extracto de DA disminuyó significativamente la viabilidad celular de HepG2 y LLC-PK1, y se asoció con un aumento significativo de la liberación de LDH. Queda por determinar si esta toxicidad podría atribuirse a la cantidad de alcohol utilizada en el extracto de la planta. De hecho, se ha demostrado que el alcohol aumenta el número de células apoptóticas [ 14 , 15 ] y conduce a la inducción de enzimas intracelulares como la alcohol deshidrogenasa y la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) [ 16 ]. De acuerdo con el efecto observado, la citotoxicidad del etanol depende de la dosis y ocurre dentro de las 24 h in vitro [ 17].] El efecto del etanol debe evaluarse como vehículo en nuestras células. Se debe medir la cantidad de etanol en el extracto de DA. La dosis de 100 mg / ml de extracto de DA no es segura a pesar de que se conoce el vehículo alcohólico. Esta dosis debe usarse con precaución.
El efecto citoprotector de este extracto también se examinó mediante el uso de un estrés oxidativo inducido por glucosa [ 18 , 19] Dado que los estudios de citotoxicidad discutidos en el párrafo anterior revelaron que la dosis de 100 mg / ml no era segura para las células, se utilizó una concentración más baja de 30 mg / ml en este conjunto de estudios, además de las concentraciones de 1 mg / ml. ml y 10 mg / ml. Las concentraciones de 1 mg / ml y 10 mg / ml de DA disminuyeron eficientemente el estrés oxidativo inducido por la glucosa. Una recuperación total de la viabilidad celular a la dosis de 10 mg / ml durante las 24 h de exposición sugirió una actividad antioxidante muy eficiente. Por lo tanto, las concentraciones de 1 mg / ml y 10 mg / ml fueron seguras y también citoprotectoras. Este efecto citoprotector de bajas concentraciones de DA contra el estrés oxidativo inducido por la glucosa debe ponerse en paralelo con la detección de estas propiedades antioxidantes. De hecho, se demostró que un extracto hidroalcohólico de DA tenía actividades antioxidantes depuradoras,2 O 2 [ 20 ]. La prueba celular, la prueba de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) y la 2,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónica) (ABTS) han demostrado el efecto antioxidante depurador de un extracto hidroalcohólico de hojas de DA [ 20 ] Los resultados de las pruebas DPPH y ABTS, expresados en mg de equivalentes de vitamina C por g de peso seco, fueron 8.47 y 12.83, respectivamente. Los niveles de ROS medidos por citometría de flujo reveló, a una concentración de 25 mg / ml, una disminución de 83% del nivel de ROS generado por H exógena 2 O 2. En el presente estudio, el pretratamiento con 30 mg / ml de DA no proporcionó ninguna protección. El hecho de que las dos concentraciones más bajas de este estudio tengan un efecto protector, contrario a la dosis de 30 mg / ml, también puede atribuirse al etanol. En realidad, también se demostró que el tratamiento con etanol altera los niveles de antioxidantes in vitro , lo que resulta en la generación de ROS y un mayor estrés oxidativo [ 21 ]. Por lo tanto, dosis bajas son suficientes para obtener un efecto protector, mientras que a concentraciones más altas, el estrés oxidativo impulsado por el alcohol en el extracto parece aniquilar la actividad protectora de la DA. La generación de ROS por H exógena 2 O 2 ha demostrado ser inhibida por un pre-tratamiento con el extracto de DA de una manera similar a nuestro estudio [ 9]
En conclusión, las concentraciones más bajas (1 mg / ml y 10 mg / ml) son seguras para las células y protegen contra el estrés oxidativo. Los extractos de DA utilizados como medicina tradicional como suplementos de salud alimentaria en Europa por su eficacia sobre el estrés en humanos deben usarse en la dosis más baja.
AVISO IMPORTANTE
La información que se muestra es solo para fines informativos y educativos, y no debe interpretarse como un consejo médico. Si está experimentando algún síntoma de enfermedad, siga los consejos de su autoridad de salud/Médico.
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